Description du produit .cp_wz table {border-top : 1px solide #ccc;border-left:1px solide #ccc ; } .cp_wz table td{border-right : 1px solide #ccc ; border-bottom : 1px solide #ccc ; remplissage : 5px 0px 0px 5px;} .cp_wz table th {border-right : 1px solid #ccc;border-bottom : 1px solid #ccc ; rembourrage : 5px 0px 0px 5px ;}
Poids moléculaire :
569.74 UNC1999 est un inhibiteur puissant, biodisponible et sélectif par voie orale de EZH2 et EZH1 avec une IC50 de 2 nM et 45 nM, respectivement, montrant une sélectivité > 1000 fois sur une large gamme de cibles épigénétiques et non épigénétiques.
Activité biologique UNC1999 est très puissant pour les mutants EZH2 Y641N et EZH2 Y641F in vitro. UNC1999 provoque des réductions dépendantes de la concentration de H3K27me3 dans les cellules MCF10A avec une CI50 de 124 nM, tout en présentant une faible toxicité cellulaire. UNC1999 affiche une inhibition puissante et dépendante de la concentration de la prolifération cellulaire avec une CE50 de 633 nM dans une lignée cellulaire DLBCL hébergeant le mutant EZH2Y641N. De plus, UNC1999 biotinylé enrichit EZH2 à partir de lysats cellulaires HEK293T, et peut donc être utilisé dans des études de chimioprotéomique. Le traitement d'UNC1999 (150 et 50 mg/kg, ip) conduit à des concentrations plasmatiques d'UNC1999 supérieures à sa CI50 cellulaire sur 24 heures in vivo. De plus, UNC1999 est également biodisponible par voie orale chez la souris, ce qui rend les études animales chroniques plus pratiques et plus pratiques.
Dosage de proximité par scintillation Les dosages d'activité de la méthyltransférase sont effectués en surveillant l'incorporation du groupe méthyle marqué au tritium de la S-adénosylméthionine (3H-SAM) aux substrats peptidiques biotinylés à l'aide du dosage de proximité par scintillation (SPA) pour le complexe trimérique PRC2-EZH2 (EZH2:EED:SUZ12 ), complexe pentamérique PRC2-EZH1 (EZH1:EED:SUZ12:RBBP4:AEBP2), SETD7, G9a, GLP, SETDB1, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, SUV39H2, complexe tétramérique MLL1 (MLL:WDR5:RbBP5:ASH2L), PRMT1, PRMT3, complexe PRMT5-MEP50 et SMYD2. Le tampon de réaction pour SMYD2 et SMYD3 est du Tris 50 mM pH 9,0, du DTT 5 mM, du TritonX-100 à 0,01 % ; pour G9a, GLP et SUV39H2 sont 25 mM de phosphate de potassium pH 8,0, 1 mM d'EDTA, 2 mM de MgCl2 et 0,01 % de Triton X-100; et pour les autres HMT 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM DTT, 0,01 % TritonX-100. Pour arrêter les réactions enzymatiques, 10 L de chlorhydrate de guanidine 7,5 M sont ajoutés, suivis de 180 L de tampon, mélangés et transférés dans une FlashPlate 384 puits. Après mélange, les mélanges réactionnels sont incubés et les comptages CPM sont mesurés à l'aide d'un lecteur de plaques Topcount. Les comptes de CPM en l'absence de composé pour chaque ensemble de données sont définis comme une activité de 100 %. En l'absence de l'enzyme, les comptes de CPM dans chaque ensemble de données sont définis comme bruit de fond (0 %). Les valeurs IC50 sont déterminées en utilisant des concentrations de composés allant de 100 nM à 100 M. Les valeurs IC50 sont déterminées à l'aide du logiciel SigmaPlot. Les dosages EZH2-Y641F sont réalisés en utilisant 30 nM d'enzyme dans 20 mM de Tris pH 8, 5 mM de DTT, 0,01 % de Triton X-100, 5 M de SAM et 1 M de peptide H3 (1-24) (comme pour le sauvage- type complexe PRC2-EZH2). Pour le DNMT1, le dosage est effectué en utilisant l'ADNdb hémiméthylé comme substrat. Le substrat dsDNA est préparé par annelage de deux brins complémentaires (brin direct bioteinté : BGAGCCCGTAAGCCCGTTCAGGTCG et brin inverse : CGACCTGAACGGGCTTACGGGCTC), synthétisés par Eurofins MWG Operon. Le tampon de réaction est du Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, du DTT 5 mM, du Triton X-100 à 0,01 %. Les tests d'activité de la méthyltransférase pour DOT1L sont effectués à l'aide de plaques filtrantes. Les mélanges réactionnels dans du Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, du DTT 5 mM, du MgCl2 2 mM et du Triton X-100 0,01 % sont incubés à température ambiante pendant 1 h, 100 L de TCA 10 % sont ajoutés, mélangés et transférés sur plaque filtrante. Les plaques sont centrifugées à 2000 tr/min pendant 2 min, suivies de 2 lavages supplémentaires au TCA à 10 % et d'un lavage à l'éthanol (180 L) suivis d'une centrifugation. Les plaques sont séchées et 100 L de MicroO sont ajoutés et centrifugés. 70 L de MicroO sont ajoutés et les CPM sont mesurés à l'aide du lecteur de plaques Topcount.
Méthode
Les cellules DB, une lignée cellulaire diffuse de lymphome à grandes cellules B hébergeant la mutation EZH2 Y641N, sont obtenues à partir de l'ATCC et cultivées dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal, des antibiotiques et diverses concentrations de composés (DMSO contrôle, UNC1999 ou UNC2400). Le milieu contenant le composé à tester ou témoin est renouvelé tous les 3 jours. Les nombres de cellules viables provenant d'au moins trois expériences indépendantes sont mesurés à l'aide du système de compteur de cellules automatisé TC20. Les histones totales sont préparées à partir de noyaux cellulaires en utilisant un protocole d'extraction acide. Environ 1 ug d'histones totales est séparé en utilisant 15 % de SDS-PAGE, transféré sur des membranes en PVDF et sondé avec des anticorps d'histone. Les anticorps utilisés dans cette étude sont ceux contre EZH2, H3 général et H3K27me3.

Groupes de Produits : Épigénétique > Inhibiteur de l'histone méthyltransférase