Description du produit Poids moléculaire : 632,65 Le forétinib (GSK1363089) est un inhibiteur compétitif de l'ATP de HGFR et VEGFR, principalement pour Met et KDR avec une CI50 de 0,4 nM et 0,9 nM. Moins puissant contre Ron, Flt-1/3/4, Kit, PDGFRα/β et Tie-2, et peu d'activité contre FGFR1 et EGFR. Phase 2.
Activité biologique XL880 inhibe les tyrosine kinases de la famille des récepteurs HGF avec des valeurs IC50 de 0,4 nM pour Met et 3 nM pour Ron. XL880 inhibe également KDR, Flt-1 et Flt-4 avec des valeurs IC50 de 0,9 nM, 6,8 nM et 2,8 nM, respectivement. XL880 inhibe la croissance des colonies de cellules B16F10, A549 et HT29 avec une CI50 de 40 nM, 29 nM et 165 nM, respectivement. Une étude récente indique que XL880 affecte la croissance cellulaire différemment dans les lignées cellulaires du cancer gastrique MKN-45 et KATO-III. XL880 inhibe la phosphorylation des molécules de signalisation MET et en aval dans les cellules MKN-45, tout en ciblant GFGR2 dans les cellules KATO-III. Une dose orale unique de 100 mg/kg de XL880 par gavage entraîne une inhibition substantielle de la phosphorylation de la Met de la tumeur B16F10 et de la phosphorylation du récepteur induite par le ligand (p. 24 heures. Le traitement avec XL880 (30-100 mg/kg, une fois par jour, gavage oral) entraîne une réduction de la charge tumorale. La charge tumorale à la surface du poumon est réduite de 50 % et de 58 % après un traitement avec 30 et 100 mg/kg de XL880, respectivement. Le traitement au XL880 de souris portant des tumeurs solides B16F10 entraîne également une inhibition de la croissance tumorale dose-dépendante de 64 % et 87 % à 30 et 100 mg/kg, respectivement.
Pour les deux études, l'administration de XL880 est bien tolérée sans perte significative de poids corporel. XL880 est développé pour cibler la signalisation anormale de HGF par Met et cibler simultanément plusieurs récepteurs tyrosine kinase impliqués dans l'angiogenèse tumorale. XL880 a provoqué une hémorragie tumorale et une nécrose dans les xénogreffes humaines en 2 à 4 heures, et une nécrose tumorale maximale est observée à 96 heures (après cinq doses quotidiennes), entraînant une régression complète.
Essai d'inhibition de la kinase L'inhibition de la kinase est étudiée à l'aide de l'un des trois formats d'essai : transfert de [33P]phosphoryle, chimiluminescence couplée à la luciférase ou technologie AlphaScreen tyrosine kinase. Les CI50 sont calculées par analyse de régression non linéaire en utilisant XLFit.33P -Phosphoryl Transfer Kinase Assay Les réactions sont effectuées dans des plaques de microtitrage à 384 puits blanches, à fond transparent, à liaison élevée (Greiner, Monroe, NC).
Les plaques sont recouvertes de 2 g/puits de substrat protéique ou peptidique dans un volume de 50 L de tampon de revêtement contenant 40 g/mL de substrat (poly(Glu, Tyr) 4:1, 22,5 mM Na2CO3, 27,5 mM NaHCO3, 50 mM NaCl et 3 mM NaN 3. Les plaques enduites sont lavées une fois avec 50 L de tampon de dosage après une nuit d'incubation à température ambiante (RT).Les composés à tester et les enzymes sont combinés avec du 33P-γ-ATP (3,3 μCi/nmol) dans un volume total de 20 L. Le mélange réactionnel est incubé à TA pendant 2 heures et terminé par aspiration.
Les plaques de microtitration sont ensuite lavées 6 fois avec du tampon Tween-PBS à 0,05 % (PBST). Du liquide de scintillation (50 L/puits) est ajouté et 33P incorporé est mesuré par spectrométrie à scintillation liquide à l'aide d'un compteur à scintillation MicroBeta.Les réactions de dosage par chimiluminescence couplée à la luciférase sont menées dans des plaques de microtitrage blanches à 384 puits à liaison moyenne (Greiner).
Dans une première étape, l'enzyme et le composé sont combinés et incubés pendant 60 minutes ; les réactions sont initiées par addition d'ATP et de substrat peptidique (poly(Glu, Tyr) 4:1) dans un volume final de 20 L et incubé à température ambiante pendant 2 à 4 heures. Après la réaction de kinase, une aliquote de 20 L de Kinase Glo (Promega, Madison, WI) est ajoutée et le signal de luminescence est mesuré à l'aide d'un lecteur de plaques Victor. La consommation totale d'ATP est limitée à 50 %. Test AlphaScreenTM Tyrosine Kinase Des billes donneuses recouvertes de streptavidine et des billes acceptrices recouvertes d'anticorps anti-phosphotyrosine PY100 sont utilisées. Du poly(Glu,Tyr) 4:1 biotinylé est utilisé comme substrat.
La phosphorylation du substrat est mesurée par ajout de billes donneur/accepteur par luminescence après la formation d'un complexe donneur-accepteur. La kinase et les composés à tester sont combinés et pré-incubés pendant 60 minutes, suivis de l'ajout d'ATP et de poly(Glu, Tyr) biotinylé dans un volume total de 20 L dans des plaques de microtitrage blanches à 384 puits à liaison moyenne (Greiner). Les mélanges réactionnels sont incubés pendant 1 heure à température ambiante. Les réactions sont stoppées par l'ajout de 10 L de 15-30 g/mL de suspension de billes AlphaScreen contenant 75 mM de Hepes, pH 7,4, 300 mM de NaCl, 120 mM d'EDTA, 0,3 % de BSA et 0,03 % de Tween-20. Après 2 à 16 heures d'incubation à température ambiante, les plaques sont lues à l'aide d'un lecteur AlphaQuest.
Méthode
Les cellules B16F10, A549 et HT29 (1,2 × 103 par puits) sont mélangées avec de la gélose molle et ensemencées dans une plaque à 96 puits contenant 10 % de FBS et EXEL-2880 sur une couche de base de gélose. Pour les conditions normoxiques, les plaques sont incubées (37°C) pendant 12 à 14 jours dans 21% d'oxygène, 5% CO2 et 74% d'azote, tandis que l'incubation (37°C) en conditions hypoxiques se fait dans une chambre d'hypoxie en 1 % d'oxygène, 5 % de CO2 et 94 % d'azote. Le nombre de colonies est évalué dans chaque condition après ajout de 50 % de bleu d'Alamar et détection de fluorescence.

Groupes de Produits : Protéine Tyrosine Kinase > Inhibiteur du PDGFR